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HLA分型技術
主要組織相容性復合物（MHC）是脊椎動物體內zui復雜且具有高度多態(tài)性的基因群。1984年George Snell 發(fā)現(xiàn)小鼠MHC即H－2，1958年Dausset 發(fā)現(xiàn)了人的MHC即HLA基因。MHC的表達產物稱為主要組織相容性抗原，MHC抗原是有核細胞表面膜蛋白分子，對抗原遞呈和免疫信號傳遞起關鍵作用。

HLA基因，位于6號染色體上短臂上，長約4000Kb。HLA是目前所知人體zui復雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，有幾十個基因座位，每個基因座位又有幾十個等位基因，且呈共顯性表達。由于MHC基因位于同一條染色體上，其多基因座位上的基因型組合相對穩(wěn)定，很少發(fā)生同源染色體間交換，這就構成了以單元型（HAPLOTYPE，即在同一條染色體上緊密連鎖的一系列等位基因的特殊組合）為特征的遺傳。按中國人常見的A座位基因有13個，B座位基因有30個計算，可組成的單元型約有13×30＝390種之多。理論上估計，父母各給一串單元型給子女，便會形成4.3萬種HLA－AB血型。事實上，HLA 各基因并非*隨機地槌傻ピ?，而蕼\氏殖雋黃膠猓╨inkage disequilibrium,LD）的特點。理論推測的HLA 分型數量巨大，但對一個具體的民族來說并非如此。世界上各個民族人群的HLA多態(tài)性和單元型都有各自的特點?？傮w來講，中國北方漢族、北美白人和北美黑人人群的多態(tài)性較中國南方漢族和日本人群豐富。即使在中國，地區(qū)間也存在差異。在中國漢族群體中抗原A1、A3、B13、B44和B51頻率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。在中國漢族群體中常見的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10單體型頻率呈北高南低分布，在江浙滬漢族人群中頻率較北方漢族人群下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58- DRB1*13單體型頻率呈北低南高分布。HLA多態(tài)性程度可見一斑。

HLA研究涉及免疫學、生物學、遺傳學、分子生物學、醫(yī)學等多個學科，并已發(fā)展成為一個獨立的學科分支。迄今HLA研究已達到相當深入的水平，并在諸多方面取得顯著進展，包括HLA復合體結構；HLA分子結構及其表達的調控；HLA分子功能，尤其是在抗原處理、呈遞及T細胞識別中的作用；HLA的DNA分型及多態(tài)性研究；HLA與疾病的關系；HLA與移植的關系等。HLA研究不僅使器官移植成為一種極有價值的治療手段，并給基礎與臨床免疫帶來了突破性進展。已經證實，HLA復合體中存在控制免疫應答的基因以及HLA參與約束免疫細胞間相互作用，這表示HLA涉及生命活動的各個水平與多個方面?？梢灶A期，對HLA的研究將繼續(xù)成為免疫遺傳學zui活躍的部分；對HLA的應用將擴展到基礎、臨床、預防醫(yī)學的各個領域。

縱觀HLA系統(tǒng)的研究過程，其發(fā)展無不與技術的手段的突破與運用有密切關系。70年代到80年代末期主要是血清學研究；90年代以來，HLA進入了分子水平研究階段，進展尤為顯著。HLA分型技術同樣走過了這一歷程。建立于60年代并不斷完善的血清學及細胞學分型技術主要側重于分析HLA產物特異性。

血清學分型借助的是微量淋巴細胞毒試驗（microlymphocytotoxicitytest）或稱補體依賴的細胞毒試驗（complement dependent cytotoxicity test，CDC）。取已知HLA抗血清加入待測外周血淋巴細胞，作用后加入兔補體，充分作用后加入染料，，著染的細胞為死亡細胞，依據特異性抗體介導的補體系統(tǒng)對靶細胞溶解的原理，待檢淋巴細胞表面具有已知抗血清所針對的抗原。血清學分型存在諸多缺點：①標準分型抗體親和力較弱、效價較低、易產生交叉反應，②缺少某些單價抗血清；③某些病理過程可能導致外周血淋巴細胞表面抗原性質發(fā)生改變．干擾抗原—抗體反應；④國內供HLA—I類抗原分型的血清板來源困難、質量欠佳。上述因素均嚴重影響了HLA分型結果的可靠性及該技術的推廣應用。

細胞學分型技術指的是通過純合分型細胞（homozygote typing cell,HTC）及預致敏淋巴細胞試驗（primed lymphocyte test,PLT）對HLA分型。二種方法的基本原理均是判斷淋巴細胞在識別非己HLA抗原決定簇后發(fā)生的增殖反應。由于分型細胞來源困難以及操作手續(xù)繁瑣，細胞學分型技術下正逐漸淘汰。

1991年第11屆HLA專題討論上提出了HLA的DNA分型方法，這類方法近年來在研究和應用方面發(fā)展非?？?，有取代其他方法的趨勢。DNA分型方法主要分為兩種：基于核酸序列識別的方法和基于序列分子構型的方法。下面簡要的闡述各方法的原理和優(yōu)缺點。

基于核酸序列識別的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。

PCR-RFLP：其原理是將目的基因片段PCR擴增后，利用多種限制性內切酶對擴增產物進行酶切，不同的基因序列會產生不同的酶切產物，從而產生不同的電泳圖譜。它以其簡單、敏感、準確，無需同位素等優(yōu)點成為目前較常用的HLA基因分型技術之一，但是無法分辨雜合子，且只能區(qū)分有限的多態(tài)性。

PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）：也稱PCR-ASO（allele specific oligonuCEOtide）。用以同位素或非放射性標記的探針與PCR擴增的目標片斷產物雜交，根據陽性斑點判斷個體基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探針對每個DNA樣品要進行多次雜交（甚至十幾次）才能完成定型分析操作也十分繁瑣。于是在此基礎上又發(fā)展起來一種反向雜交法（reverse hybridization）。將各種不同的探針固定于同一張膜上，再將PCR產物標記，以PCR產物（待檢測基因DNA）反過來與探針雜交。這樣一次雜交即可完成多個等位基因分析。此方法具有靈敏度、特異性強、需樣本量少等優(yōu)點，但不同探針的雜交條件的須嚴格統(tǒng)一（如溫度，離子強度）, 易出現(xiàn)誤差;不能檢測新等位基因，試劑盒需不斷升級; 對某些雜合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多態(tài)性，而僅僅由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT（4.01＃113）。此方法適宜大量和高純度樣本，雜交條帶將作為書面原始記錄長期保存（三種效果比較）。

PCR-SSP：上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，zui終均需用標記的特性探針與擴增產物進行雜交，再分析結果。PCR/SSP方法用乃設計出一整套等位基因組特異性引物（sequence specific primer,SSP），借助PCR技術獲得HLA型別特異的擴增產物，可通過電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡化了實驗步驟。優(yōu)點是簡單易行, 分辨率可從低到高, 成本低。缺點是不易自動化;不能檢測新的等位基因，試劑盒需不斷升級。此方法適宜零散和純度低樣本，重復實驗時要重提DNA和必須使用紫外凝膠成象儀保留原始資料，增加實驗成本（三種效果比較）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量試劑（引物）,且不能識別非經典的HLA基因和假基因（綠）。針對HLA外顯子和內含子序列精心設計引物可避免這些問題。

PCR-SBT: 以PCR擴增所要分析的基因片斷，然后對DNA序列進行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大規(guī)模進行，度高，能直接發(fā)現(xiàn)新的等位基因。但是由于雜合子的存在，無法分辨單元型。

以上各個方法都存在無法克服的缺陷，如能配合使用，則能大大提高分型能力。國外有學者對60個樣本進行研究，發(fā)現(xiàn)單用SBT，只有18％的樣本能將A，B位點同時分型成功，如結合SSO，則能將所有樣本成功分型。

基于核酸序列識別的分型方法始終無法越過雜合子的難關。HSE（Haplotype-specific extention）技術地解決了這一問題。它是利用磁珠與其中一條同源染色體的特異位點結合，達到分離同源染色體的目的，雜合子問題不攻自破。因此，HSE無論與SSO還是SBT結合使用，都有*的效果（1.01＃12，4.01＃94）。

近年來，測序新技術發(fā)展層出不窮，紛紛運用到HLA分型中。如E（multiplex single nucleaotide extention）,應用鏈中止法原理，根據等位基因SNP位點設計特異性引物和生物素熒光標記的ddNTP進行分型，有重復性好，可分辨雜合子等優(yōu)點，已應用到A位點的分型中。（4.01＃93）又如pyrosequencing 法分型，分辨率好，可分辨雜合子，自動化程度也高。DNA芯片技術，作為一項檢測SNP的成熟技術，也已應用到HLA 分型中.

基于序列分子構型的分型方法在理論上就避開了雜合子這個難題。SSCP（PCR單鏈構象多態(tài)性分析，PCR-single strand conformational polymorphism）是zui常用的根據構型的分型方法。擴增的目標產物變形后形成單鏈，不同的序列，甚至僅有一個堿基的差異，就會形成不同的莖環(huán)結構，從而電泳速率不同。但此方法于分辨于200－300bp（綠16），且即使是同一單鏈DNA在相同情況下也會形成不同的構型，使得電泳條帶很難分析;也有可能會出現(xiàn)當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小的情況,使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。

HA（異源二聚體電泳多態(tài)性，Heteroduplex Analysis）是另一種基于序列分子構型的分型方法，根據異源二聚體未配對區(qū)域的長度和分布而顯示出電泳條帶不同（綠18）。但與單鏈DNA相比，異源二聚體電泳條帶過于復雜，難以分析。

新發(fā)展的RSCA（Reference Strand Mediated Conformation Analysis）技術根據HA的原理，設計了位點特異性熒光標記的參照DNA片段，與樣本DNA分子的正反鏈形成異源二聚體.帶有熒光標記的電泳條帶易于分析，能夠克服HA的不足。

另外，提取基因組模板的技術也在不斷發(fā)展。用于分型的DNA來源也已不局限于血液，口腔涂片、唾液中提取的DNA也有相似的效果（7.01＃261）。針對微量基因組模板的情況，現(xiàn)已開發(fā)出基于滾環(huán)復制的全基因組擴增技術，可以將1ng的模板擴大至100ng，足以應付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技術的要求。